一、液相色譜柱的使用

    色譜柱在使用前，進(jìn)行柱的性能測試，并將結果保存起來(lái)，作為今后評價(jià)柱性能變化的參考。在做柱性能測試時(shí)要按照色譜柱出廠(chǎng)報告中的條件進(jìn)行（出廠(chǎng)測試所使用的條件是*條件），只有這樣，測得的結果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同。

    1.樣品前處理

    a、使用流動(dòng)相溶解樣品。

    b、使用預處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。

    c、使用0.45µm的過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì)。

    2.流動(dòng)相的配置

    液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：

    a、流動(dòng)相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì )沉淀在柱中（或長(cháng)時(shí)間保留在柱中）。

    b、流動(dòng)相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應

    c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；降低柱壓降，延長(cháng)泵的使用壽命（可運用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度）。

    d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，使用對紫外吸收較低的溶劑配制。

    e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導致實(shí)驗無(wú)法進(jìn)行。

    f、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。

    3、流動(dòng)相流速的選擇

    因柱效是柱中流動(dòng)相線(xiàn)性流速的函數，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求*柱效，使用*流速。對內徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對于內徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。

    當選用*流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(cháng)?？刹捎酶淖兞鲃?dòng)相的洗滌強度的方法以縮短分析時(shí)間（如使用反相柱時(shí)，可適當增加甲醇或乙腈的含量）。

    注意：

    a．流動(dòng)相要求使用0.45µm濾膜過(guò)濾，除去微粒雜質(zhì)。

    b．使用HPLC級溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長(cháng)色譜柱的使用壽命，提高柱性能。

    4.流動(dòng)相平衡：

    a、在進(jìn)行樣品檢測前，至少使用20倍柱體積流動(dòng)相使色譜柱充分平衡。流動(dòng)相一定要使用色譜級別的溶劑。如使用水相的緩沖液應當天配制以保持新鮮避免細菌產(chǎn)生。

    b、流動(dòng)相使用前需用微孔濾膜過(guò)濾,消除流動(dòng)相中顆粒對色譜系統和色譜柱的損壞。緩沖液與其他流動(dòng)相混合后應重新過(guò)濾避免溶解度變化造成產(chǎn)生新的沉淀。不應使用純水作為流動(dòng)相沖洗C18色譜柱，以免柱性能損壞（添加5％的有機溶劑沖洗色譜柱，同時(shí)可以達到對緩沖鹽清洗的作用。還可以使色譜柱更容易平衡）。

    c、流動(dòng)相需脫氣后使用，可避免因氣泡導致的泵和檢測器的工作不正常。如果測試時(shí)使用的流動(dòng)相與色譜柱保存使用的流動(dòng)相有較大區別，應該使用過(guò)度分布的形式進(jìn)行平衡。避免由于流動(dòng)相的突然變化造成柱壓增加過(guò)大或流動(dòng)相緩沖鹽結晶造成對色譜柱和儀器系統的損壞。正相色譜柱比反相色譜柱需要更長(cháng)的平衡時(shí)間。

    5.色譜柱的使用

    （1）柱子在裝卸、更換時(shí)，動(dòng)作要輕，接頭擰緊要適度。必須防止較強的機械振動(dòng)，以免柱床產(chǎn)生空隙。

    （2）如果儀器用來(lái)做常規分析，樣品種類(lèi)有限，但分析次數多，則不妨為每一類(lèi)常規分析配置一根柱，這樣有助于延長(cháng)柱子的壽命。

    （3）避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì )影響柱內的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會(huì )沖動(dòng)柱內填料，因此在調節流速時(shí)應該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉動(dòng)不能過(guò)緩。

    （4）應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然。大多數反相色譜柱的pH穩定范圍是2－7.5，盡量不超過(guò)該色譜柱的pH范圍

    （5）如使用柱溫控制裝置時(shí)，應注意在通人流動(dòng)相后才能升溫。

    （6）一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì )迅速降低柱效。

    （7）選擇使用適宜的流動(dòng)相，以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一個(gè)預柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。

    （8）避免將基質(zhì)復雜的樣品尤其是生物樣品直接注人柱內，需要對樣品進(jìn)行預處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一個(gè)保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經(jīng)常更換。

    （9）經(jīng)常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，對流路系統中流動(dòng)相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡，每種流動(dòng)相的體積應是柱體積的20倍左右，即常規分析需要50-75mL。

    （10）保存色譜柱時(shí)應將柱內充滿(mǎn)乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。禁止將緩沖溶液留在柱內靜置超過(guò)晚上12點(diǎn)或更長(cháng)時(shí)間。

    （11）色譜柱使用過(guò)程中，如果壓力升高，一種可能是燒結濾片被堵塞，這時(shí)應更換濾片或將其取出進(jìn)行清洗;另一種可能是大分子進(jìn)人柱內，使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現塌陷，死體積增大。

    （12）在完成分離分析工作之后，不應立即停機，需及時(shí)對色譜分析系統進(jìn)行沖洗，一般0.5h以上，以除去色譜柱內的雜質(zhì)。

    （13）如果使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽，應注意用純水"過(guò)渡"即每天分析開(kāi)始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動(dòng)相平衡；分析結束后必須先用純水沖洗30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護柱子。

    二、液相色譜柱的管理

    制定色譜柱管理的標準操作規程并嚴格執行。每一根新購進(jìn)的色譜柱必須造冊登記,內容包括:生產(chǎn)公司、品名、型號、規格、購進(jìn)時(shí)間、啟用時(shí)間、單價(jià)、柱內保護溶液等。色譜柱分類(lèi)存放,硅膠柱、化學(xué)鍵合硅膠柱、氰基或氨基柱、離子交換樹(shù)脂柱、凝膠柱各用一個(gè)色譜柱盒,盒上貼上標簽,注明類(lèi)別。隨柱說(shuō)明書(shū)裝入密實(shí)袋附在登記本上。每啟用一根色譜柱,在色譜柱上貼上標簽,注明啟用日期。每根柱子每?jì)蓚€(gè)月保養一次,特別是對于一些使用頻率少的柱子,因為放置時(shí)間長(cháng),容易干柱,每一次做好保養記錄。對于確已失效的柱子,做好停用記錄,不能隨意丟棄,專(zhuān)門(mén)存放,如果現用的柱子的填料需要填補,可以用存放的柱子的填料。在從事生產(chǎn)的單位的質(zhì)檢部門(mén),對于使用時(shí)間較長(cháng)柱效降低的柱子,可把它用于檢測產(chǎn)品的中間體。

    三、液相色譜柱的保養和再生清洗

    色譜柱使用一段時(shí)間后,常遇到柱子被污染,柱效會(huì )有一定程度的下降,采用適當的方法對色譜柱進(jìn)行保護,可以延長(cháng)色譜柱的使用壽命。

    保護柱（預柱）的使用:對于較昂貴的色譜柱,可以在柱前加一保護柱,防止樣品中雜質(zhì)污染分析柱,對于制備柱,因其進(jìn)樣量大,使用保護柱尤為重要。

    再生處理包括正反兩種順序：

    硅膠柱（未鍵合）：正己烷←→二氯甲烷←→異丙醇

    硅膠基質(zhì)非極性鍵合相（C18,C8,C4,C2,C1,PHENYL,CN,NH2）：95%水/5%乙腈（甲醇）←→乙腈（甲醇）←→THF；（含蛋白污染物）B從10％到90％的梯度，A=0.1％TFA水溶液，B=0.1％TFA乙腈溶液

    硅膠基質(zhì)極性鍵合相（CN，NH2，DIOL等）：氯仿←→異丙醇←→二氯甲烷←→庚烷

    離子交換樹(shù)脂柱（SCX/SAX等）：一般采用高濃度（1-2molL）的NaCl溶液

    油脂等物質(zhì)可用低濃度堿溶液（如0.1molL的NaOH溶液）沖洗

    酸性有機物用低pH緩沖液沖洗

    堿性有機物用高pH緩沖液沖洗,再用蒸餾水←→甲醇←→二氯甲烷沖洗。

    凝膠色譜柱（GPC/GFC等）：通常用稀的氫氧化鈉或非離子型去垢劑沖洗

    疏水蛋白可用24%或30%乙腈沖洗超過(guò)晚上12點(diǎn)除去

    親水蛋白可用30%-50%乙酸除去

    痕量胃蛋白酶可用蛋白水解酶處理分解,再用蒸餾水←→甲醇←→蒸餾水沖洗。

    建議清洗柱子的其他條件：

    溶劑體積：推薦使用柱體積的10-20倍

    流速：推薦使用常規流速的1/5-1/2

    不同流動(dòng)相轉換：推薦換相時(shí)濃度梯度由小到大