色譜柱的柱效能是評價(jià)色譜性能的一項重要指標，混合物能否在色譜柱中得到分離，除取決于選擇合適的固定相外，還與色譜操作條件及色譜柱的裝填狀況等因素有關(guān)。

　　高效液相色譜柱的正確使用包含：加裝保護柱，過(guò)濾流動(dòng)相和樣品，凈化樣品，避免過(guò)高的柱壓，注意溫度和酸堿度，正確及時(shí)的沖洗等。

　　1、加裝保護柱

　　保護柱的作用是過(guò)濾掉來(lái)自流動(dòng)相和樣品的化學(xué)“拉圾”同時(shí)也可以有效除去流動(dòng)相和樣品中的不溶物。盡管現在的色譜儀在流動(dòng)相吸入口、進(jìn)樣閥后部以及在色譜柱的兩端都裝有1、2μm等不同孔徑的濾器,但濾器只能除去不溶性顆粒而不能除去化學(xué)污然,因此,加裝保護柱是必要的,特別是在分析中藥、中成藥等復雜混合物和生物樣品時(shí)更是保護分析柱不可少的措施。

　　保護柱填料應與分析柱一致,粒徑可較分析柱大。保護柱屬消耗品,經(jīng)過(guò)一定次數的樣品分析(50～100次)后,出現柱壓顯著(zhù)升高或峰形變壞或基線(xiàn)漂移時(shí),應考慮更換保護柱。

　　2、過(guò)濾流動(dòng)相和樣品

　　流動(dòng)相通常由水或緩沖溶液與有機溶劑混合而成,原則上,所有經(jīng)過(guò)色譜柱的流動(dòng)相均應過(guò)濾,但在實(shí)際操作上應視具體情況而有所區別:當有機溶劑用色譜純級,水用石英亞沸水或其它超純水時(shí),在能確保水和有機溶劑的質(zhì)量且沒(méi)有受到污染時(shí),過(guò)濾并無(wú)更多實(shí)際意義。

　　當流動(dòng)相中含有緩沖鹽時(shí),則過(guò)濾是必要的,如前所述,當緩沖溶液放置一段時(shí)間(視環(huán)境溫度不同而異,夏季一般不超過(guò)48 h,冬季一般不超過(guò)一周)后,在使用前還應重新過(guò)濾。

　　所配制的樣品試液在注入流路系統前均要經(jīng)0. 45μm ( 0. 22μm則更好)孔徑濾膜過(guò)濾。要注意區分水系和油系,二者不可混用,以防止濾膜溶解而造成污染。

　　裝流動(dòng)相的容器和色譜系統中的在線(xiàn)濾器要定期清洗和更換,以避免濾器因過(guò)載而起不到過(guò)濾作用。

　　3、凈化樣品

　　當樣品中含有對色譜柱有損害的化學(xué)成分,如產(chǎn)生吸附的蛋白質(zhì)、糖等有機分子和強吸附性物質(zhì),以及可能對柱填料產(chǎn)生破壞作用的基團離子。在進(jìn)樣前應盡可能對樣品進(jìn)行分離提純以除去多余雜質(zhì)組分。

　　4、避免過(guò)高的柱壓

　　雖然高效液相色譜柱能耐受的壓力可達6000 p si (磅/平方英寸) ,但過(guò)高及過(guò)大的壓力變化均會(huì )縮短色譜柱的壽命,避免的方法是

　　(1)柱壓過(guò)高時(shí),盡可能采用較小的流速,以不超過(guò)柱最大允許壓力的一半為宜。

　　( 2)當流速較大時(shí),應采取流速梯度的辦法使流速分步到位。

　　(3)使用手動(dòng)進(jìn)樣閥時(shí),進(jìn)樣閥的切換要盡可能的快。否則超過(guò)20%的壓力沖擊會(huì )很快使柱報廢。當使用多柱聯(lián)用時(shí),柱切換要避免在高壓下進(jìn)行。

　　5、注意溫度和酸堿度

　　一般以硅膠為基質(zhì)的色譜柱最高使用溫度不超過(guò)60℃,以低于40℃為宜,特別是在流動(dòng)相pH接近使用限度時(shí),更應降低使用溫度。

　　溫度過(guò)高會(huì )加快鍵合相的水解和硅膠的溶解,從而使填料性質(zhì)改變,柱床塌陷,降低柱效,改變峰形。

　　目前的鍵合硅膠色譜柱標示的pH適用范圍可達2～10,但在實(shí)際使用時(shí)應避免pH條件,特別是在偏堿性的條件(pH≥8)下使用 ,如必須要在pH條件下使用時(shí),可通過(guò)以下方法避免柱損害:

　　( 1)在泵和進(jìn)樣閥之間加裝預柱(飽和柱)來(lái)飽和流動(dòng)相

　　(2)降低使用溫度

　　(3)檢驗完畢后立即用與所使用的流動(dòng)相互相混溶的“溫和溶劑”*清洗。

　　6、正確及時(shí)的沖洗

　　開(kāi)始試驗前,應了解柱中當前是何種溶劑。對于新色譜柱,如無(wú)特殊說(shuō)明均為評價(jià)報告中所用流動(dòng)相。柱中當前溶劑一定要與分析樣品所用流動(dòng)相互溶,如不能混溶,要用與二者均能相互混溶的第三種溶劑過(guò)渡。